因此，有必要驗(yàn)證一種或多種可以替代臨床療效研究的評估方法，以證明生物等效性（BE）。表I總結(jié)了測定局部生物利用度（BA）和BE的主要方案，可分為體外和體內(nèi)方法。表中列出了那些尚未獲得美國FDA正式批準(zhǔn)的方法，作為評估外用BA/BE的獨(dú)立方法，以及在某種程度上用于比較不同外用藥物產(chǎn)品的其他方法。

在這項研究中，我們參考Leila Bastos Leal 的研究報告，針對戊酸倍他米松（BMV）和抗真菌藥物硝酸益康唑（EN）的配方，考慮了評估外用BE的替代方法，此前已在人體志愿者的體內(nèi)角質(zhì)層剝離實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了檢測。對于BMV，這些制劑是臨時制備的，與公認(rèn)的血管收縮試驗(yàn)相比，它們彼此之間明顯不等效，作為陽性對照。以EN為例，膠帶剝離數(shù)據(jù)證實(shí)了臨床試驗(yàn)的結(jié)果，該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三種乳膏具有生物等效性。這里，兩種藥物的制劑首先使用人工膜進(jìn)行體外釋放測試，然后使用豬皮膚樣本在離外膠帶剝離方案中進(jìn)行比較。還進(jìn)行了一次有限但最終無信息的體外皮膚滲透試驗(yàn)（同樣使用切除的豬皮膚）。

1.1 配方

制備了兩種配方的戊酸倍他米松（BMV，Sigma Aldrich，Gillingham，UK）制劑，與先前描述的完全相同：（a）溶于中鏈甘油三酯（MCT）（Mygliol 812 N，Synopharm，Barsbüttel，Germany），和（b）溶于微乳液Mikro 100®（ME）（Sebapharma，Boppard，German）。將載體用6%（w/w）Aerosil®200（Sigma Aldrich）增稠成半固體凝膠。將兩種制劑中的BMV濃度調(diào)整至藥物溶解度的80%（ME和MCT分別為9.3和1.7 mg mL−1），以提供等效的熱力學(xué)活性。

與早期詳細(xì)的人體膠帶剝離研究類似（相關(guān)閱讀：使用ivrt研究局部作用藥物的體外體內(nèi)相關(guān)性），考慮了三種市售硝酸益康唑（EN）配方（1%w/v）：參考上市產(chǎn)品Fougera®（E.Fougera&Co.，Melville，NY），以及Perrigo（紐約布朗克斯）和Taro（紐約霍桑）的兩種仿制乳膏（在FDA橙色書中列為AB）。

1.2 體外釋放實(shí)驗(yàn)（IVRT）

1.3 體外皮膚滲透

IVPT實(shí)驗(yàn)方法如表3所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后拆卸擴(kuò)散池，并保留整個接受室溶液用于滲透藥物的分析。

1.4離體膠帶剝離實(shí)驗(yàn)

取1.3中實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的豬皮，按照下面的要求做離體實(shí)驗(yàn)。

• 對于BMV，首先用干紙巾擦拭，然后使用該干燥擦拭程序，再加上使用兩個連續(xù)的70%v/v異丙醇棉簽清潔皮膚表面殘余的制劑。

• 對于EN，皮膚表面清潔程序僅使用酒精棉簽

隨后，對于這兩種藥物，將皮膚牢牢地固定在聚苯乙烯板上，并用模板界定中心區(qū)域，其面積等于暴露于制劑的面積。然后，通過膠帶剝離依次去除該部位的角質(zhì)層（SC）。在膠帶剝離過程之前和整個過程中同時進(jìn)行的經(jīng)表皮水分損失（TEWL）。測量表明，大部分SC被去除（此時TEWL已達(dá)到100g/m2/h或更高的值）為終點(diǎn)；這樣做所需的膠帶條數(shù)約在8至30條之間。

然后，通過用合適體積（在兩種情況下均為1mL）的提取溶劑（對于BMV為40:60v/v乙腈：水，對于EN為純甲醇）震蕩過夜，從粘合劑中提取藥物，來確定每個膠帶條上去除的藥物量。為了優(yōu)化檢測靈敏度，通常以4個為一組對來自深層SC的膠帶進(jìn)行分析。

在單獨(dú)的一系列EN實(shí)驗(yàn)中，皮膚表面在6小時內(nèi)清潔殘余制劑后，將組織置于烘箱中（保持在32°C；皮膚的真皮層要充分補(bǔ)水）。再過17小時后，SC膠帶剝離過程完全如上所述進(jìn)行。這項工作的目的是模擬早期人體體內(nèi)研究的“藥物清除”期。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 IVRT 體外釋放實(shí)驗(yàn)

結(jié)果以累積藥物釋放量作為時間的函數(shù)表示，并比較了不同配方的行為。評估了描述釋放曲線的最合適函數(shù)（例如，線性、t1/2動力學(xué)）。

1.5.2離體膠帶剝離

如果在6小時內(nèi)未檢測到可測量的BMV或EN滲透進(jìn)入擴(kuò)散池受體室時，則無需解釋此類數(shù)據(jù)。

• 對于BMV，在吸收6小時后，整個SC的藥物濃度分布(C作為深度位置x的函數(shù))符合初始無藥物SC表面(x = 0)恒定載藥濃度(Cveh)的Fick第二擴(kuò)散定律：

以導(dǎo)出SC載體分配系數(shù)（K）的值以及藥物的SC擴(kuò)散率與SC厚度平方的比值（D/L2），如先前工作中所述。此外，使用SC厚度的獨(dú)立評估來估計SC上的滲透系數(shù)（kp）和穩(wěn)態(tài)通量（Jss）。

• 在EN的情況下，對結(jié)果進(jìn)行了更直接的分析，反映了在人類志愿者中進(jìn)行的膠帶剝離研究中所采用的方法。在這里，藥物的吸收和清除是由立即或清潔后17小時收集的SC膠帶條中回收的總藥物量來確定的

   

  1.6 統(tǒng)計分析

• 由于本研究的目的不是考慮的兩種藥物的不同配方之間建立生物等效性，因此本研究的體外和體外部分所采用的重復(fù)次數(shù)并非基于嚴(yán)格的冪函數(shù)計算。相反，選擇的“n”值與先前體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中使用的值相匹配（BMV的n=6，EN的n=14）。

• 統(tǒng)計分析采用雙尾Student‘s t檢驗(yàn)和單、雙因素方差分析（ANOVA）以及Bonferroni’s檢驗(yàn)；p值小于0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

  

  2.1 IVRT實(shí)驗(yàn)結(jié)果
  

• 使用BMV制劑的IVRT顯示，沒有可測量量的藥物穿過多孔疏水膜或硅膠膜進(jìn)入接受室。然而，在親水膜上觀察到BMV釋放。微乳凝膠（ME）在6小時內(nèi)釋放1430（±161）μg cm−2，而中鏈甘油三酯制劑（MCT）的相應(yīng)量為7.7（±0.8）μg cm−2。這兩個量的巨大差異可能是由于表面活性劑從ME凝膠中同時擴(kuò)散，促進(jìn)BMV在接受室中的溶解所致。對于這兩種制劑，藥物釋放都用典型的時間依賴性平方根來描述。

• 檢測到所用三種膜中每一種膜上所有三種制劑中EN的釋放（圖1）。盡管在6小時內(nèi)釋放的累積量根據(jù)所用的膜而具有顯著差異（ANOVA隨后進(jìn)行事后測試），但在每個膜內(nèi)，三種制劑的藥物釋放沒有顯著差異，與產(chǎn)品原設(shè)計一致——不同人工膜并不影響藥物是否一致的判斷。

  

2.2 IVPT測試

2.2.1 BMV的IVPT研究結(jié)果

在6小時實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，在接受溶液中未發(fā)現(xiàn)BMV，表明在如此短的時間內(nèi)無論使用何種載體，其都無法穿過皮膚。EN也是如此，這一發(fā)現(xiàn)與早期的人體膠帶剝離研究一致，其結(jié)果表明滯后時間約為13小時

圖2（左圖）顯示了作為SC內(nèi)位置的函數(shù)的BMV濃度曲線，該曲線是在用凝膠化中鏈甘油三酯（MCT）和微乳液（ME）凝膠制劑處理6小時后通過離體膠帶剝離實(shí)驗(yàn)確定的；在這些實(shí)驗(yàn)中，用干紙巾擦拭皮膚表面。將數(shù)據(jù)與已發(fā)表的人體志愿者體內(nèi)研究的相應(yīng)結(jié)果（右圖）進(jìn)行比較

l如上所述導(dǎo)出的分配和表觀擴(kuò)散參數(shù)如圖3所示，以及6小時時進(jìn)入SC的藥物總量，以及滲透系數(shù)和表觀穩(wěn)態(tài)通量的估計值。這些結(jié)果再次與早期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)報告的結(jié)果進(jìn)行了比較。對于這兩種制劑，在體外獲得的研究參數(shù)與人體研究的參數(shù)非常一致（且無顯著差異）；同樣，從志愿者的人體膠帶剝離實(shí)驗(yàn)中觀察到，與MCT制劑相比，微乳液中BMV滲入SC的量和藥物的表觀穩(wěn)態(tài)通量幾乎高出一個數(shù)量級（體外8.7倍，體內(nèi)7.2倍）。

當(dāng)用異丙醇棉簽更嚴(yán)格地清潔皮膚，重復(fù)體外實(shí)驗(yàn)時，兩種制劑的Q6h值都降低了約50%（數(shù)據(jù)未顯示），證實(shí)了這種方法是去除殘留制劑的更可靠的方法。

2.2.2 EN的IVPT測試結(jié)果

硝酸益康唑（EN）的離體膠帶剝離實(shí)驗(yàn)采用與已發(fā)表的人體研究相同的方案進(jìn)行。重復(fù)測定相同數(shù)量的SC對藥物的吸收和清除，注意在三種乳膏中暴露6小時后徹底清潔皮膚表面，并確保在膠帶剝離過程中基本上去除所有SC。圖4報告了在6小時滲入和隨后的17小時清除期后從SC中回收的EN的量。

對吸收和清除結(jié)果的方差分析表明，所考慮的三種配方之間沒有顯著差異。同樣值得注意的是，對于每種EN乳膏，在吸收和清除期后SC中回收的藥物量之間沒有顯著差異。所得數(shù)據(jù)的平均值以及上下90%置信區(qū)間（C.I.）收集在表II中。

表2 服用三種藥物后服用和清除期SC中EN的平均量（n=14），以及相應(yīng)的90%置信區(qū)間上限和下限（C.I.）

由于所測試的三種乳膏中的每一種的吸收和清除值難以區(qū)分，因此使用兩種測試配方（Perrigo和Taro）的平均值與參考配方（Fougera）的[吸收+清除]比率和組合結(jié)果評估產(chǎn)品之間的等效性。使用原始數(shù)據(jù)（圖4）和對數(shù)轉(zhuǎn)換結(jié)果進(jìn)行計算。在0.8至1.25（2，17）的常規(guī)范圍內(nèi)，結(jié)果基本相同，總結(jié)在表III中

表3 模擬生物等效性評估，基于組合[攝取+清除]數(shù)據(jù)（n=28），以Fougera為“參考產(chǎn)品”，Perrigo和Taro為“測試”的三種EN cream之間

IVRT結(jié)果顯示了所考慮的兩種藥物之間的不同行為。一方面，通過使用的三種不同的人工膜，可以很容易地測量三種測試產(chǎn)品中EN的釋放。此外，不同配方的釋放特性在每個膜上都是相同的。然而，當(dāng)比較從不同膜獲得的數(shù)據(jù)時，這些圖譜在定量上沒有重疊，并且穿過親水纖維素屏障的圖譜形狀與穿過兩個疏水膜的圖譜形狀不同（圖1）。對于BMV來說，在6小時內(nèi)，藥物無法通過兩個疏水膜釋放，推測這反映了藥物在這些人工膜屏障中的高溶解度。相比之下，通過親水纖維素的釋放是可檢測的，并以經(jīng)典的時間平方根依賴進(jìn)行，親水膜能夠區(qū)分了測試的兩種配方。

從這些實(shí)驗(yàn)中得到的信息應(yīng)該是明確的，并且在之前就已經(jīng)被闡明。具體而言，盡管IVRT可以提供關(guān)于（例如）不同生產(chǎn)批次一致性的有用質(zhì)量的控制信息，但僅從這些測量值預(yù)測藥物在體內(nèi)的相對或絕對生物利用度是不明智的。EN數(shù)據(jù)表明，釋放的量因所用膜的不同而不同，通過膜“傳遞”的量甚至可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于僅在同一時期進(jìn)入SC的量。盡管IVRT顯示的三種EN產(chǎn)品的表觀等效性在體內(nèi)和體外條帶剝離研究中都得到了反映（并且確實(shí)與臨床表現(xiàn)一致），但應(yīng)根據(jù)BMV的結(jié)果仔細(xì)考慮任何推斷的相關(guān)性。對于這種藥物，在兩種情況下，IVRT顯示沒有藥物滲透。因此，單一的人工膜不僅不太可能用于所有藥物的IVRT方法的標(biāo)準(zhǔn)化，而且，即使有，它也能夠模仿在真實(shí)皮膚上的任何配方效果（例如，作為滲透促進(jìn)劑的輔料的作用）。

使用BMV進(jìn)行的離體SC膠帶剝離實(shí)驗(yàn)顯示出與先前發(fā)表的人體研究（圖2和圖3）在定性和定量上表現(xiàn)出非常好的一致性。結(jié)果表明，仔細(xì)進(jìn)行的離體皮膚研究（在這種情況下，離體皮膚來自公認(rèn)的和普遍認(rèn)為可接受的人體屏障模型可以有效地預(yù)測體內(nèi)情況，如前所述。雖然這一策略不太可能最終演變成任何形式的監(jiān)管指南，但替代的體外方法在配方開發(fā)和優(yōu)化方面可能具有吸引力。

從與先前發(fā)表的人體數(shù)據(jù)的相關(guān)性角度來看，EN離體膠帶剝離研究的結(jié)果是混合的。從積極的方面來看，6小時內(nèi)藥物滲入離體豬皮膚的SC與人體數(shù)據(jù)完全相關(guān)，（正確地）證明了測試的三種藥物產(chǎn)品之間的等效性（表II和III）。相反，盡管研究中清除部分的結(jié)果自洽，因?yàn)樗鼈円脖砻髁伺浞降牡刃裕▓D4），但數(shù)據(jù)與早期的體內(nèi)觀察有所不同。在體內(nèi)，在清除階段，益康唑的SC水平降低了約30%，但在離外條件，沒有降低。對這一觀察結(jié)果最有可能也是最明顯的解釋是，切除的皮膚缺乏正常的微循環(huán)，因此無法提供清除像益康唑這樣的親脂性藥物所需的吸收條件。因此，該活性部分傾向于保留在SC中，并且在去除殘余制劑后的17小時內(nèi)不會顯著耗盡。這意味著，用于評估局部生物等效性的離體膠帶剝離方法可能無法常規(guī)提供關(guān)于“皮膚藥代動力學(xué)”消除方面的信息，特別是對于具有高log P值的藥物。然而，這并不意味著這些實(shí)驗(yàn)毫無價值；相反，吸收階段的數(shù)據(jù)對于優(yōu)化體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計以及為臨床評估所考慮的原型制劑的性能提供有價值的見解非常有用。盡管如此，對這里使用的方案做適當(dāng)修改可能允許這種方法也闡明了清除過程；例如，保持皮膚與大體積的接受室接觸，或使用流通選項，以及使用切除皮膚的較薄部分是值得研究的策略。

總之，本研究的結(jié)果證實(shí)，IVRT和SC膠帶剝離等技術(shù)是表征局部藥物產(chǎn)品性能的可靠方法，有助于活性藥物成分在皮膚中的最終生物利用度。然而，這里使用的每種方法都有上文所述的局限性：

• IVRT可以解決配方質(zhì)量的特點(diǎn)，但不能報告產(chǎn)品與皮膚的相互作用方式

• SC離體膠帶剝離允許很好地預(yù)測體內(nèi)藥物進(jìn)入SC的吸收，但是，關(guān)于藥物清除率的測定，需要仔細(xì)注意實(shí)驗(yàn)設(shè)計的優(yōu)化。