通常導致溶出方法需要被調(diào)查的場景包括：

• 不合規(guī)格結(jié)果（OOS）

• 趨勢外結(jié)果（OOT）

• 結(jié)果可變性增加

• 進展到第2或3階段測試

• 溶媒準備過程中的觀察到問題

• 溶出過程中觀察到異常

• 實驗室或溶出設(shè)備之間方法轉(zhuǎn)移過程中的不可比性

• 引入自動化溶出裝置

本綜述參考James Mann等的《Dissolution Method Troubleshooting: An Industry Perspective》內(nèi)容，對溶出方法調(diào)查和異常處理的經(jīng)驗教訓和最佳實踐進行了總結(jié)。此外，還提供了真實的行業(yè)案例研究，以舉例說明導致溶出測試方法異常的各種異常成因，并為各位研究溶出的同仁帶來偏差調(diào)查與溶出度實驗管理的啟迪。

溶出的偏差調(diào)查

溶出實驗可被視為三種不同的活動的總和：獲取分析用樣品的程序、樣品的分析和化學分析溶出結(jié)果的計算。我們建議實驗室的調(diào)查工作常常使用魚骨圖（圖1）來展開。它是一個因果系統(tǒng)的可視化表示，可以幫助分析問題的根本原因，并廣泛用于制藥行業(yè)的各種應(yīng)用。它允許對所有可能被忽視的潛在原因進行頭腦風暴。用于溶出調(diào)查的魚骨分為六個重點領(lǐng)域：設(shè)備、方法、物料、計算、人員和環(huán)境。這些領(lǐng)域中的每一個都是在溶出方法偏差調(diào)查的背景下進行小組討論的。

1. 物料

在任何溶出方法調(diào)查中要考慮的物料主要分為三類：用于制備溶出介質(zhì)的成分、標準品和測試的藥物產(chǎn)品。

1.1 溶出介質(zhì)的制備

對于溶出介質(zhì)，簡單檢查試劑重量以及是否使用了正確等級的試劑是一個很好的起點。觀察到的常見錯誤包括未正確理解磷酸鹽等水合鹽。例如，使用二水合物而不是一水合物或無水鹽，這會對緩沖液濃度產(chǎn)生后續(xù)影響。無水鹽如果儲存不當，可能會與水結(jié)合，這可能會導致稱量制備合適緩沖液濃度所需的正確鹽質(zhì)量的問題。

此外，一元鹽和二元鹽可以以與通常不同的方式混合并調(diào)節(jié)至正確的pH，這與使用正確的鹽相比，會產(chǎn)生不同的介質(zhì)總組成。通過確保記錄物料添加的明確順序和調(diào)整前的預期pH值，以及與預期pH值的任何差異，分析師可以暫停并檢查pH值超出預期值的原因，從而避免這種情況。

對于大部分溶出介質(zhì)的制備，必須確保其充分混合，這在從濃縮物中稀釋以確保在等分之前形成均勻的溶液時尤為重要。例如，案例研究2表明，對于緩沖系統(tǒng)中50L或更大的介質(zhì)體積，需要1min/L或更長的混合時間。此外，如果使用pH值作為大型容器混合的確認，則應(yīng)從不同深度的多個點取樣。

標準做法還應(yīng)確保所有試劑均已正確儲存，且在保質(zhì)期內(nèi)。還應(yīng)考慮緩沖液的污染，無論是來自使用未充分沖洗的相同設(shè)備的先前溶出介質(zhì)，還是來自微生物污染。后者的一個例子是儲存在水溶液中的氦噴射玻璃料內(nèi)的微生物生長，通過確保氦氣噴射玻璃料在使用之間儲存在甲醇 : 水（50:50）中，解決了這個問題。

第一個案例研究說明了在使用溶出介質(zhì)濃縮液時，不正確的介質(zhì)制備和人為錯誤的綜合影響。第二個案例研究說明了大量溶出介質(zhì)不全部混合的影響，以及驗證溶出介質(zhì)制備質(zhì)量的pH測量的局限性。

案例1：從濃縮液中制備溶出介質(zhì)

在500mL pH 5.5的乙酸鹽緩沖液中，使用槳法以75rpm進行片劑制劑的溶出試驗。為方便起見，制備了10倍的緩沖液濃縮液，并在每次分析之前使用溶媒制備系統(tǒng)用水簡單稀釋至最終緩沖液濃度。圖2顯示了遵循該程序的開發(fā)批次的溶出曲線，顯示了快速且穩(wěn)定的釋放。在第一次臨床批量發(fā)布期間，應(yīng)用上述方法時觀察到虛線曲線，導致OOS結(jié)果。

在調(diào)查過程中，確定pH 5.5的最終1x乙酸鹽緩沖液再次稀釋1:10，假設(shè)其仍然是10倍濃縮液。因此，以低10倍的濃度制備溶出緩沖液。用正確制備的緩沖液重復溶出分析。如圖2所示，臨床批次的溶出符合第2階段的溶出接受標準（30分鐘時Q=80%）。開發(fā)批次和第一批臨床批次之間的差異歸因于顆粒粒度分布的差異，這在隨后的研究中進行了分析。

一般來說，緩沖濃縮液的使用增加了可變性的來源；然而，這一過程的時間和資源效益被認為是對這一潛在錯誤的補償。此外，精心設(shè)計的控制措施，如審計跟蹤和文件檢查，即使在早期開發(fā)階段，也能確保過程和產(chǎn)品質(zhì)量。

案例研究2：固體試劑制備緩沖液

膠囊制劑的溶出試驗使用槳法以75rpm在900mL pH 5.5的檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖液中進行。為方便起見，通過將固體鹽溶出在制備容器中的水中并攪拌直至預期全部溶出來制備大量緩沖液。進行pH測量以驗證緩沖液制備是否正確。使用這種溶出方法通?？梢杂^察到快速和穩(wěn)健的分布。然而，在初始穩(wěn)定性期間，一個時間點的測試顯示出異常高的變異性，多個OOS結(jié)果。這是在多個膠囊強度、批次和儲存條件下觀察到的。對溶出數(shù)據(jù)的系統(tǒng)研究揭示了特定批次制備的溶出介質(zhì)中溶出行為隨時間變化的趨勢。圖3顯示了不同測試批次在45分鐘時的藥物釋放百分比（六次重復的平均值），作為測試順序的函數(shù)繪制。每個垂直網(wǎng)格線代表一個測試日，并指示單獨的介質(zhì)準備。

進一步的研究揭示了150L的溶出介質(zhì)制備，攪拌78分鐘。雖然攪拌時間和溶出介質(zhì)體積本身都不是非典型的，但較短的混合時間和較大混合溶媒體積的組合導致了一種假設(shè)，即混合不充分，且溶媒成分在其使用中不一致。為了驗證這一假設(shè)，收集了這批溶出介質(zhì)中收集的溶出樣品，并測試了pH、電導率、滲透壓和鈉、檸檬酸鹽和磷酸鹽的離子濃度。

圖4顯示了45分鐘時的溶出情況以及作為測試順序函數(shù)的介質(zhì)pH值和電導率。綠色帶表示正確制備的介質(zhì)的pH值和電導率的預期范圍。溶出性能與所用等分溶媒的pH值直接相關(guān)。盡管所用介質(zhì)前半部分的pH值符合規(guī)范（導致如預期的溶出），但除使用中點附近的一小部分介質(zhì)外，所有介質(zhì)的電導率都在正確范圍之外。測量的滲透壓摩爾濃度和離子濃度與電導率的趨勢相似，盡管有一些偏差。實際上，沒有一份溶出介質(zhì)的成分正確。對該裝置的大批溶媒制備的溶媒體積和混合時間的分析導致需要1min/L或更長的混合時間，以確保50L或更大體積的溶媒充分混合。

本案例研究表明，pH值測量不是正確的溶媒制備或混合程度的充分指標。如果未使用其他度量（例如電導率），則如果要使用pH值確認混合，則應(yīng)從大型容器不同深度的多個點取樣。這也說明了保存樣本解決方案的好處，直到所有數(shù)據(jù)都得到分析、趨勢化，所有所需的調(diào)查都完成。

1.2 表面活性劑

如果化合物表現(xiàn)出較差的溶出度，則表面活性劑通常是用于實現(xiàn)漏槽條件的溶出介質(zhì)的成分。十二烷基硫酸鈉（SLS）是一種常用的表面活性劑，盡管它可能是溶出缺陷的來源，如在鉀離子存在下沉淀。不同等級的SLS質(zhì)量可能會在溶出試驗的分析完成過程中因雜質(zhì)引起干擾，并可能影響介質(zhì)的增溶能力。接下來的兩個案例研究證明了表面活性劑對溶出的潛在非預期影響，例如表面活性劑由于活性物質(zhì)的存在而導致樣品降解（案例研究3）以及表面活性劑與藥物物質(zhì)結(jié)合，阻礙溶出（案例研究4）。

案例研究3：表面活性劑引起的降解

藥物在溶出介質(zhì)中的化學穩(wěn)定性是方法開發(fā)過程中需要考慮的重要因素。如果藥物在溶出介質(zhì)中降解，溶出試驗期間檢測到的藥物量可能比實際溶出的藥物量低得多。由于在特定pH條件下的化學不穩(wěn)定性，經(jīng)常觀察到藥物降解，在開發(fā)方法時，應(yīng)在溶出介質(zhì)選擇過程中考慮到這一點。在某些情況下，溶出介質(zhì)中的雜質(zhì)（可由表面活性劑引入）可加速活性藥物的降解。

在本案例研究中，配制成速釋薄膜包衣片劑的化合物X表現(xiàn)出氧化降解，在某些情況下，在溶出試驗的后期時間點導致溶出量明顯減少（圖5）。

即使在不太異常的情況下，降解不會導致溶出時間點的明顯趨勢，溶出樣品溶液的評估也發(fā)現(xiàn)溶液穩(wěn)定性非常有限，不到24小時。對降解途徑的進一步研究發(fā)現(xiàn)，在樣品溶液中生成了兩種已知的氧化降解產(chǎn)物，通過高效液相色譜（HPLC）進行了定量，這兩種產(chǎn)物都是在活性藥物成分（API）的過氧化物脅迫下形成的。

這導致了一種假設(shè)，即這種降解是由于Fenton型與聚山梨醇酯80（其作為溶出介質(zhì)中的表面活性劑）中存在的過氧化物的反應(yīng)，由源自片劑薄膜涂層的鐵催化。Fenton反應(yīng)包括通過Fe（II）/Fe（III）催化將有機過氧化物轉(zhuǎn)化為過氧基和烷氧基。減少溶出過程中降解的緩解策略集中于過氧化物和鐵成分（例如使用下圖的鍍膜槳葉）。

已知聚山梨醇酯表面活性劑在暴露于空氣中時會發(fā)生氧化降解，過氧化物在表面活性劑中積聚。從不同供應(yīng)商獲得的多批聚山梨醇酯80中定量過氧化物的量，并打開不同的時間長度。基于這些結(jié)果，聚山梨醇酯80的使用期限被限制在從打開起的30天內(nèi)，并且確定了優(yōu)選的供應(yīng)商。此外，向溶出介質(zhì)中加入乙二胺四乙酸（EDTA），通過螯合催化鐵（II）和鐵（III）離子來提高樣品穩(wěn)定性，從而防止產(chǎn)生過氧和烷氧基。也有報道稱，螯合劑可能不會抑制Fenton反應(yīng)，而是淬滅生成的自由基。事實上，發(fā)現(xiàn)這種方法可以顯著減少溶出樣品中化合物X的氧化降解，使樣品的穩(wěn)定性達到3天，在此期間僅損失0.2%的效力。值得注意的是，與不含EDTA的樣品相比，含有EDTA的樣品表現(xiàn)出特征氧化降解產(chǎn)物的最小增長。因此，對溶出方法進行了修訂，將EDTA加入溶出介質(zhì)中。

還探討了向溶出介質(zhì)中加入丁基化羥基甲苯（BHT）以淬滅過氧基和烷氧基。觀察到氧化降解產(chǎn)物的生長較低，但在樣品溶液中形成了化合物X-BHT加合物。因此，在這種情況下，BHT不是改善溶液穩(wěn)定性的可行添加劑。

案例研究4：溶出介質(zhì)的表面活性劑污染

膠囊制劑的溶出試驗使用槳法以75rpm在900mL pH 5.5的檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖液中進行。在將溶出方法轉(zhuǎn)讓給第三方期間，觀察到與方法開發(fā)期間觀察到的溶出性能相比，溶出性能下降。已知在足夠大的SLS濃度下，藥物物質(zhì)與SLS形成不溶性絡(luò)合物。圖6顯示了設(shè)計方法（無SLS）和SLS濃度范圍內(nèi)的溶出情況。在10 ppm SLS下，無法全部釋放。

在調(diào)查過程中，發(fā)現(xiàn)溶出介質(zhì)制劑試劑瓶之前接觸過SLS。此外，使用高分辨率液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析導致意外低溶出性能的溶出介質(zhì)，結(jié)果顯示其含有0.3ppm SLS。SLS的這一水平與方法轉(zhuǎn)移過程中觀察到的溶出性能下降一致。因此，新的藥筒專門用于該藥物產(chǎn)品，確保只有該項目的溶出介質(zhì)接觸表面。這一實踐以及設(shè)備和介質(zhì)相互作用的完整歷史，對于準確測試對某些雜質(zhì)的痕量濃度敏感的化合物非常重要。

1.3 酶

溶出測試中使用的另一種需要仔細考慮的物料是：當觀察在溶出實驗中到明膠膠囊交聯(lián)時使用的酶。例如，USP通用章節(jié)“溶出"規(guī)定，在二級測試期間，可以向溶出介質(zhì)中添加“導致活性不超過750000單位/L的胃蛋白酶"。這意味著要正確計算添加到溶出介質(zhì)中的酶的質(zhì)量，需要考慮USP級酶的分析證書（CoA）上的值。通常對于胃蛋白酶，需要使用蛋白質(zhì)的百分比和蛋白質(zhì)的單位/mg來正確計算所需的量。閱讀CoA時應(yīng)謹慎，因為一些供應(yīng)商報告蛋白質(zhì)和胃蛋白酶單位/mg蛋白質(zhì)的百分比，而其他供應(yīng)商則直接報告胃蛋白酶單位/mmg產(chǎn)品?；蛘?，可以根據(jù)USP程序通過實驗測定活性。還應(yīng)注意，美國藥典關(guān)于最大胃蛋白酶活性的規(guī)范是以濃度給出的。因此，在改進的Tier 2方法中，在添加表面活性劑之前，將酶添加到較低體積的緩沖液中，應(yīng)適當計算較小體積的酶添加量。

1.4 標準品

應(yīng)確認標準品的同一性和相關(guān)純度，當標準品是不同于待溶出分析藥物的鹽或共晶形式時，應(yīng)特別注意效價轉(zhuǎn)換。紫外分析常用作溶出檢測方法。因此，由于在最終值中考慮了有機雜質(zhì)，標準品的UV純度值通常與色譜分析中使用的值不同。

1.5 樣品

最后，溶出樣品本身存在可變性和誤差，因此應(yīng)進行檢查，以確保其正確性、適當?shù)臉撕灐⑦m當?shù)膶嶒炇覂Υ婧驼_的包裝。通常，溶出方法調(diào)查得出的結(jié)論是，方法或分析沒有發(fā)現(xiàn)問題，這會引發(fā)對產(chǎn)品制造的進一步調(diào)查。這種程度的調(diào)查超出了本文的范圍。然而，在充分了解特定樣品的預期性能的情況下，在方法研究中使用控制或參考樣品通常是有用的，因為這有助于確定問題是否與方法或測試的單個批次有關(guān)。

2.設(shè)備

方法問題的最大原因是溶出設(shè)備。這可能是由于在基本上相同的設(shè)備上運行的方法，但分析人員沒有意識到制造商、水浴模型、自動化方法和/或軟件之間存在的一些根本差異。

在設(shè)備調(diào)查期間進行簡單的初始檢查，就像檢查是否與之前的實驗和設(shè)備維護目視檢查有任何不同一樣簡單。檢查儀器日志、運行報告和實驗中的任何錯誤日志，通?？梢栽谶\行之前或運行期間識別系統(tǒng)中的任何異常。應(yīng)驗證浴槽的合格狀態(tài)，確保所有運行前檢查，例如溫度和槳葉高度。觀察到的一個例子是，分析人員未能進行正確的運行前檢查，并且未能觀察到一溶出杯中的槳滑到25mm以下，并撞擊在溶出杯底部的藥片。

已經(jīng)觀察到金屬表面在酸性介質(zhì)中的降解，導致藥物物質(zhì)的金屬催化降解。這也可能是取樣套管和自動取樣器針的問題。因此，確保設(shè)備維護良好且無任何表面銹蝕是確保結(jié)果一致的關(guān)鍵步驟。聚四氟乙烯（PTFE）涂層槳可用于解決這一問題；然而，需要注意涂層不會被劃傷，因為劃痕可能會導致降解區(qū)域或在實驗過程中出現(xiàn)過飽和的成核位置。

如果使用籃法（USP裝置1），則必須檢查是否使用了正確的網(wǎng)目尺寸，以及籃的狀況是否可以接受，因為這些籃筐通常容易因處理不當而變形。為了防止這種情況，可以使用工具插入和移除籃子，而不會使網(wǎng)格變形。

2.1 脫氣設(shè)備

如果脫氣對方法性能至關(guān)重要，則應(yīng)檢查脫氣設(shè)備，以確保其提供足夠質(zhì)量的介質(zhì)。這可以通過使用溶解氧計對介質(zhì)進行外部檢查來實現(xiàn)，以確保37°C時的濃度低于6 mg/L。脫氣失敗的例子是由于易腐蝕片劑表面存在氣泡而導致溶出較慢，導致片劑與介質(zhì)接觸減少，以及由于篩網(wǎng)被氣泡堵塞而導致通過籃式篩網(wǎng)的介質(zhì)流量減少。當氣泡增加了顆粒的浮力并導致錐形減少，導致整個容器中的固體更加分散時，也觀察到由于脫氣不足而導致的更快溶出。

2.2 紫外分光光度計

如果紫外分光光度計通過儀器自檢，則不太可能出現(xiàn)問題；然而，應(yīng)確認UV波長的設(shè)置方法是正確的。如果使用含有比色皿轉(zhuǎn)換裝置的在線UV發(fā)現(xiàn)單個溶出杯OOT問題，則應(yīng)檢查該溶出杯線上是否連接了正確的路徑長度的導管。同樣值得檢查的是，所有配件是否牢固，因為松動的配件可能會導致空氣進入導管或無法將正確的樣本量拉過來比色皿中，這可能會導致異常讀數(shù)，從而影響溶出曲線。

2.3 自動溶出系統(tǒng)

溶出方法的自動化和自動化系統(tǒng)之間的轉(zhuǎn)移通常是問題的根源。這可能是因為分析師不了解系統(tǒng)如何收集樣本。自動進樣器參數(shù)（如初始體積、凈化體積、泵流量和系統(tǒng)管道體積）的錯誤選擇或定義可能會導致問題。這些設(shè)置不僅存在于單獨的方法設(shè)置中，還作為系統(tǒng)配置文件的一部分，并且根據(jù)您是收集到小瓶中還是進行在線UV，體積有所不同；例如，如果使用注射器過濾器，體積將發(fā)生變化。不正確的設(shè)置可能會導致自動采樣器無法在下一個時間點之前完成所有活動，導致無法在所需時間采集樣本，或者充注和吹掃不足可能會導致采樣管線中的前一個時間，從而稀釋下一個時間點，產(chǎn)生低于預期的結(jié)果。第五個案例研究中展示了自動取樣器設(shè)置的影響

案例5：自動取樣設(shè)置

在槳法上對25°C/60%相對濕度（RH）和30°C/75%相對濕度下儲存的12個月穩(wěn)定性樣品進行了速釋片劑制劑的溶出試驗。30°C/75%相對濕度的樣品在溶出度儀A上使用它的自動采樣器B運行，而25°C/60%相對濕度條件的樣品在也使用它的另一款自動取樣器C上運行。30°C/75%RH樣品的溶出曲線比25°C/60%RH樣品慢。藥物溶出百分比的差異在5分鐘時接近40%，在60分鐘時大約10%。之前在早期的穩(wěn)定時間點沒有發(fā)現(xiàn)這種差異。12個月的30°C/75%相對濕度曲線與早期穩(wěn)定時間點的曲線相比，也是OOT。

在初步實驗室調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)兩臺自動取樣器B與C雖然型號相同，但方法設(shè)置不同。用于運行30°C/75%相對濕度樣品的自動取樣器的泵流量為10 mL/min，采集偏移量（offset volume）為2.0 mL，而用于運行25°C/60%相對濕度樣品，自動取樣器的流量為15 mL/min，偏移量（offset volume）為3.5 mL。偏移量（offset volume）定義為樣品采集前丟棄的介質(zhì)體積。據(jù)推測，溶出曲線的差異是由自動進樣器設(shè)置的差異造成的。

再次運行12個月的30°C/75%RH片劑，自動進樣器方法設(shè)置更改為15 mL/min流速和3.5 mL偏移量。圖7顯示了來自兩種不同自動進樣器方法設(shè)置的30°C/75%RH片劑的兩種溶出曲線的比較。在15mL/min流速和3.5mL偏移體積下獲得的新曲線比之前在10mL/min流速和2.0mL偏移體積下得到的曲線更快。在改變自動采樣器方法設(shè)置的情況下，12個月30°C/75%相對濕度樣本的分布與25°C/60%相對濕度樣本以及之前穩(wěn)定時間點的歷史趨勢相匹配（使用相同的自動采樣器設(shè)置）

為了調(diào)查哪個參數(shù)更為關(guān)鍵，即流速或偏移量，再次使用自動取樣器將30°C/75%RH樣品設(shè)置為10 mL/min流速和3.5 mL偏移量。與之前使用15 mL/min流量和3.5 mL偏移量獲得的曲線相比，沒有觀察到溶出曲線的顯著差異，表明低偏移量（2.0 mL）是初始運行時溶出曲線似乎較慢的根本原因。較低的偏移量不足以清除之前取樣時間點殘留在管道中的樣品。

最后，為了進一步證實這一發(fā)現(xiàn)，制備了預溶出的藥物溶液，并使用不同的自動進樣器設(shè)置（2.0 vs.3.5 mL偏移體積，15 mL/min流速）進行了兩次試驗。每個容器的取樣針在水中放置5分鐘時間點，然后在15分鐘的下一個時間點放置到含有預溶出溶液的容器中。使用3.5 mL的偏移體積，結(jié)果顯示在15分鐘時幾乎100%溶出，與預溶出濃度一致。在2.0-mL的偏移量下，結(jié)果小于65%的溶出回收率，表明管道中殘留的水具有顯著的稀釋效果。這一觀察結(jié)果證實，3.5mL的偏移量足以沖洗掉之前的樣品，而2.0mL則不足以。本案例研究證明了理解自動取樣器功能的重要性，并使用足夠的偏移量來替換管道中的先前樣品，確保樣品代表實際采樣點。

同時調(diào)查觀察到的自動化引起的其他問題包括：0% 溶出在一個溶出杯中，然后在下一次運行中，由于片劑卡在樣品盒中，導致200%溶出。該問題可能由片劑幾何形狀引起（或加?。赡苄枰_保片劑的最小尺寸與溶出系統(tǒng)的片劑分配機構(gòu)中的孔徑一致對齊。

半球底部裝有閥門的全自動系統(tǒng)的另一個常見問題是，容易出現(xiàn)錐體的配方會加劇錐體，這是因為與傳統(tǒng)設(shè)計相比，容器底部整體“更平坦"。下一個案例研究側(cè)重于自動化設(shè)備之間的方法轉(zhuǎn)換，以及設(shè)備設(shè)計的差異如何導致水動力差異。這些流體動力學差異可能導致對流體動力學敏感的產(chǎn)品的釋放曲線產(chǎn)生較大影響。

案例6：自動化系統(tǒng)之間的差異

當對同一批固體口服藥物產(chǎn)品使用相同方法時，不同儀器（半自動溶出度儀E和全自動溶出度儀F）之間的溶出曲線存在差異。該方法為槳法，75rpm，pH3.5緩沖液。在一臺儀器的溶出曲線中觀察到錐體效應(yīng)，但在另一臺儀器中觀察不到錐體效應(yīng)。

檢查兩臺儀器后，發(fā)現(xiàn)全自動系統(tǒng)F的采樣探頭直徑大于半自動系統(tǒng)E的。取樣探頭尺寸的差異可能會導致容器內(nèi)流體動力學的差異，并導致兩個系統(tǒng)之間的樣品沉積或錐體差異。

構(gòu)建了三個模擬全自動系統(tǒng)F采樣探針尺寸的采樣探針，以替換半自動系統(tǒng)E上六個采樣探針中的三個（圖8A）。

使用兩種類型的探針進行了溶出運行，以比較該系統(tǒng)的溶出曲線和錐體行為。在該溶出運行完成時，切換兩種取樣探頭的位置，并進行第二次溶出運行，以消除因容器位置引起的任何潛在偏差。圖8B顯示了這些平均溶出曲線（標記為批次B）以及先前獲得的半自動系統(tǒng)E（標記為A批次）的溶出曲線，以及各自的采樣探針。

在半自動系統(tǒng)E中使用改進的采樣探針改變了溶出曲線。在60分鐘時觀察到的錐體效應(yīng)較小，并且溶出曲線看起來與使用全自動系統(tǒng)F獲得的溶出曲線更相似

確定是錐體效應(yīng)導致溶出結(jié)果異常后，實驗室更新了溶出方法，以使用尖峰溶出杯來最小化錐體效應(yīng)，消除對取樣管尺寸的敏感性，并在儀器E與F之間實現(xiàn)可再現(xiàn)的溶出曲線。

與此示例類似，以下案例研究也關(guān)注自動化以及容器設(shè)計和設(shè)置中的微小差異如何影響溶出。

案例7：手動取樣與自動取樣的差異

由于藥典法規(guī)規(guī)定溶出度儀的標準化，使溶出方法很容易轉(zhuǎn)移到其他地點，因此在開發(fā)過程中，通常使用手動取樣（手動取樣針）作為參考方法。如果獲得與手動方法類似的結(jié)果，則可以引入溶出自動取樣以提高測試效率降低勞動強度。

在本例中，在早期開發(fā)期間使用了全自動系統(tǒng)G。配方過程的改變導致片劑的崩解行為發(fā)生改變，需要重新評估手動和自動系統(tǒng)之間的可比性。為了進行溶出曲線比較，使用了三種不同的儀器：溶出度儀H為手動采樣，用離線紫外分光光度計測量樣品；溶出度儀I與在線紫外分光度計耦合用于半自動在線測量；全自動系統(tǒng)G與在線紫紫外分分光光度儀耦合用于全自動測量。溶出方法是槳法，溶媒是900mL pH 4.5緩沖液，緩沖液含有0.2%SLS。

與兩個自動系統(tǒng)相比，手動溶出H抽取的樣品產(chǎn)生了最慢且不相似的釋放曲線（圖9A），全自動系統(tǒng)G測量了最快的溶出速率。為了研究在線紫外測量過程中半自動和全自動系統(tǒng)中的影響，如管道和泵的體積，在兩個系統(tǒng)中的溶出運行過程中抽取了手動樣本。與自動取樣和測量相比，手動取樣和平行離線測量產(chǎn)生了類似的溶出曲線（圖9B和9C）。因此，不同溶出曲線的原因必須是溶出度儀溶出杯本身的某種原因。與在手動取樣過程中使用可伸縮套管的溶出度儀H不同，兩個自動系統(tǒng)I與G中的樣品都是通過中空軸取樣口抽取的。該取樣口是一個小網(wǎng)眼插入物（圖9D），導致槳軸內(nèi)的表面部分不光滑。此外，全自動系統(tǒng)G（圖9D）中的底部閥是在正常光滑的玻璃溶出容器底部插入件。因此，空心軸和底部閥都會影響溶出杯內(nèi)的流體動力學，并在流體流場中產(chǎn)生局部差異。在本案例研究中，片劑對溶出杯內(nèi)流體動力學的變化非常敏感，導致崩解和溶出增加。這使得無法使用全自動系統(tǒng)G建立全自動溶出方法。

3. 溶出方法

在任何調(diào)查期間，應(yīng)根據(jù)批準的方法檢查方法參數(shù)。這些包括槳速、容器溫度、介質(zhì)、參考標準制備、取樣和時間點。存在這樣的例子，即在50 rpm而不是75 rpm下運行的方法存在問題；由于取樣時間點接近，且在取樣期間管線中有介質(zhì)冷卻，因此介質(zhì)溫度下降到37±0.5°C范圍之外，該系統(tǒng)在時間點之間保持管道中的體積；在制備過程中未全部溶出參考標準，導致低于計算的標準濃度；以及使用未經(jīng)該方法驗證的原位采樣探針進行采樣。由于（手動溶出試驗）分析員幾乎同時向所有容器中添加藥物，因此也觀察到不符合藥典取樣時間限制的方法存在問題。這種情況導致后來的容器在2%的窗口外取樣，因為分析員不能足夠快地取樣和過濾。此外，在將藥片放入容器之前未能停止槳葉，導致藥片在沉入容器時被移動的槳葉擊打，從而導致更快的溶出。如果沒有正確調(diào)整取樣歧管，當在500至900或1000 mL體積之間移動時，也可能會在藥典區(qū)域（槳頂部和溶媒液位之間的中間位置）外進行取樣。

3.1 過濾器

由于缺少或僅完成部分過濾器驗證，溶出過濾器可能是溶出問題的罪魁禍首。過濾器驗證應(yīng)確保正確確定廢棄體積，并在溶出曲線中預期的非常低濃度下進行（例如，在非常低濃度下的第一個時間點）。當在商業(yè)產(chǎn)品上更換過濾器并且僅在中等強度的標稱100%溶出濃度下進行丟棄體積選擇時，已經(jīng)觀察到一個例子。在測試較低的強度時，所選擇的廢棄體積不足以使過濾器適當飽和，并導致人為降低溶出結(jié)果，最終導致OOS結(jié)果。

必須完成的過濾器驗證的第二個要素是檢查過濾器效率。這可以通過在存在未溶出材料的時間點取樣并使用廢棄體積進行過濾來實現(xiàn)。然后應(yīng)分離濾液，其中一部分立即分析，第二部分在分析前進行超聲處理或進行另一種溶出方法一段時間。如果過濾器在阻止未溶出藥物方面效率低下，則第二個樣品將給出比原始樣品更高的濃度。對于LC方法來說，消除這一問題尤為重要，因為樣品可能在自動進樣器上停留數(shù)小時，并且在流動相中使用有機溶劑，這兩者都可能導致藥物顆粒溶出。然后，這些顆粒將溶出在比容器中更小的樣品體積中，對樣品濃度產(chǎn)生不成比例的影響。由于（藥物或賦形劑的）未溶出顆粒導致光散射效應(yīng)，導致基線升高，需要應(yīng)用校正技術(shù)來補償，因此過濾效率低下也會導致UV方法中的問題。理想情況下，過濾器應(yīng)能有效阻止所有顆粒進入樣品，通常，0.45µm的膜足以過濾掉大多數(shù)藥物和賦形劑，盡管許多自動化系統(tǒng)現(xiàn)在可以處理0.22µm膜過濾器的背壓。

過濾器驗證的最后一項檢查是通過過濾溶出介質(zhì)的空白溶液并分析濾液中的干擾物質(zhì)來評估可浸出物。大多數(shù)信譽良好的過濾器與常見的溶出介質(zhì)沒有問題，但在一些低質(zhì)量的濾膜供應(yīng)商中觀察到了實例。

案例研究8：溶出曲線的早期峰值

進行了溶出研究，其中在早期時間點溶出的藥物百分比高于隨后的時間點（圖10）。

在這種情況下，對未溶出的材料進行取樣，將其收集在過濾器表面上，并在過濾過程中溶出，從而產(chǎn)生更高的測量濃度。這種影響的重要性取決于過濾器表面上未溶出顆粒的溶出行為、取樣體積和取樣期間施加的壓力。

解決這個問題的方法有三個方面：

1. 1.使用連接在取樣針前端的預過濾器

2. 2.降低樣品體積，以確保仍然達到最小丟棄體積（結(jié)果是將分析方法從紫外分光光度法改為HPLC分析）

3. 3.在書面方法中仔細描述取樣程序

4. 

另一個潛在的挑戰(zhàn)是在所有時間點使用相同的過濾器過濾樣品溶液，以測定溶出曲線。這可能是為了避免在每個時間點使用過濾器的成本過高。在這些情況下，過濾器表面可能會殘留未溶出的物質(zhì)，其結(jié)果是在下一個時間點溶出，導致樣品中的濃度較高，人為測量的溶出度較高。從假陽性結(jié)果的角度來看，這也是至關(guān)重要的，因為在規(guī)范時間點，失敗的溶出性能會被接受。因此，過濾器的任何多次使用都需要仔細評估這些遺留風險。

除了選擇正確的過濾器和建立協(xié)議以允許重復結(jié)果外，過濾器外殼的幾何形狀也會對采樣產(chǎn)生影響。

案例研究9：過濾器外殼

劑量強度的增加使得有必要在溶出方法中加入表面活性劑（槳式裝置，pH 4.5緩沖液，0.3%SDS，75rpm）。溶出通常在帶有自動取樣裝置（ASD）單元的Sotax AT7智能系統(tǒng)上進行。在ASD裝置的取樣過程中，注射器柱塞推動空氣通過注射器過濾器和套管進入溶出容器，以去除可能卡住的顆粒。然后ASD通過抽取樣本并在取樣前將其推回，對過濾器進行預沖洗，隨后將其轉(zhuǎn)移到HPLC瓶中。將SLS添加到溶出介質(zhì)中，再加上1µm Pall Acrodisc過濾器（圖11B），導致起泡和不全部取樣（圖11A）。使用1µm Pall Acrodisc PSF過濾器，該過濾器由與原始過濾器相同的材料制成，但具有更小、不同形狀的外殼（圖11B），消除了起泡問題（圖11A）。盡管本示例可能對ASD設(shè)置的采樣特別敏感，但它不僅說明了過濾材料和孔徑的重要性，還說明了套管幾何形狀的重要性。

3.2 沉降籃

沉降籃可能會導致方法問題。在開發(fā)過程中，評估沉降籃設(shè)計對溶出方法性能的影響非常重要。口服控釋產(chǎn)品的一個例子是，制劑的釋放嚴重依賴于聚合物的初始水合作用。在常規(guī)溶出試驗中，觀察到了看似隨機的快速釋放片劑，并引發(fā)了調(diào)查。根本原因被確定與沉降籃有關(guān)：一組六個不合規(guī)的五線圈日式沉降籃被混合到一盒36個合規(guī)的七線圈沉降籃中。在聚合物全部水合之前，盤管數(shù)量的減少使配方受到更快速的侵蝕。這意味著實驗室應(yīng)仔細控制沉降籃組，并采用標簽管理系統(tǒng)，以確保在將沉降籃組引入實驗室之前對其進行標記和記錄。在對經(jīng)批準的產(chǎn)品進行沉降片設(shè)計轉(zhuǎn)換之前，進行全面風險評估以確保與歷史數(shù)據(jù)相等也是很重要的。

其他常見問題與藥物相對于其平衡濃度過飽和的方法有關(guān)，如下一個案例研究所示。

案例10：采樣后沉淀

在合同制造機構(gòu)（CMO）使用槳式裝置以50 rpm（60分鐘后+沖擊轉(zhuǎn)速200 rpm）在900 mL無酶模擬胃液（SGFsp）、pH 4.5的乙酸鹽緩沖液和pH 6.8的無酶模擬腸液（SIFsp）中進行具有pH依賴性溶出度的弱堿性開發(fā)藥物的比較溶出試驗。在SGFsp中溶出快速、穩(wěn)定，但在pH 4.5和SIFsp pH 6.8下觀察到高可變性和出乎意料的高溶出值（相對于低溶出度）（圖12A）

由于pH 4.5和SIFsp pH 6.8下的溶出度限制了溶出過程，并且由于在HPLC分析之前未稀釋CMO處的溶出樣品，因此評估了采樣期間/之后藥物過飽和和沉淀的假設(shè)。在沒有稀釋的情況下，在公司內(nèi)部實驗室內(nèi)重復CMO實驗，證實了高可變性和意外的高溶出值。

相反，在過濾后和HPLC分析之前引入稀釋步驟（用0.1N鹽酸1:1），得到了pH 4.5和SIFsp pH 6.8的顯著更低（如預期）和更穩(wěn)健/更少的可變?nèi)艹鼋Y(jié)果，如圖12B所示。因此，可以假設(shè)在HPLC分析過程中，沉淀的藥物顆粒最有可能從HPLC瓶中取出并注射到HPLC系統(tǒng)中。反過來，在HPLC運行期間用流動相稀釋的沉淀顆粒的注射導致了高可變性和HPLC柱上過高的“局部"藥物濃度。

4. 環(huán)境與人

溶出問題，就像所有基于實驗室的問題一樣，可能是由于在考慮不周的地點進行測試，或者是由于個人培訓不足造成的。觀察到一個訓練水平不足的例子，在人工取樣溶出時，從溶出杯1到6觀察到明顯的正偏差。這個問題是由于分析師在1分鐘的時間內(nèi)搖晃著放下藥片，而槳葉在整個時間內(nèi)都沒有轉(zhuǎn)動；在容器6中的片劑滴下后開始攪拌，然后在15分鐘取樣，再錯開1分鐘。這一過程的最終結(jié)果是，容器1中的片劑經(jīng)歷了5分鐘的停滯“浸泡"，然后是15分鐘的槳葉轉(zhuǎn)動，而容器6經(jīng)歷了20分鐘的槳葉旋轉(zhuǎn)，其他容器介于兩者之間。這被確定為實驗室培訓問題，并通過對受影響實驗室的溶出技術(shù)分析師進行再培訓，以及引入更清晰的手動溶出操作程序（即，只需停止槳足夠長的時間，使藥片下沉，然后在錯開時間再次打開槳）來解決。

溶出是一種視覺觀察非常重要的技術(shù)。專家在調(diào)查過程中的第一個問題通常是，“溶出杯的情況如何？"讓受過良好培訓的分析師在溶出過程中進行觀察，并在觀察潛在問題時使用手機或其他實驗室記錄設(shè)備拍攝照片或視頻，通?？梢宰C明這對于找到根本原因是非常寶貴的?；蛘?，在開發(fā)過程中，配備適當放置的攝像機（例如下圖的攝像裝置）和所有溶出測試的視頻記錄的儀器設(shè)置尤其有助于減輕分析師注意異?；顒印?zhí)行觀察和/或記錄證據(jù)的負擔，同時遵守采樣時間要求。觀察錐形、“舞動"、漂浮、薄膜形成、膠囊溶出過程中的破裂點、過量氣泡、泡沫或材料粘附在槳/容器上，對于確定異常溶出性能是否存在任何肉眼可見的原因非常重要。因此，在進行溶出試驗時，最好培訓分析師定期記錄目視觀察結(jié)果。

解散調(diào)查中的一個重要步驟是分析師訪談或方法演練（有時稱為Gemba walk）。通過觀察實驗室正在進行的測試，而不是假設(shè)測試是按照經(jīng)理或?qū)＜业钠谕M行的，從而在調(diào)查中取得了許多突破。在一個例子中，觀察到了方法性能的突然變化，只有在方法演練過程中，溶出專家才發(fā)現(xiàn)另一個由不同組安裝的設(shè)備在實驗室工作臺上引起了過度振動，影響了溶出測試。

環(huán)境和人的最終組成部分是數(shù)據(jù)完整性和驗證。當觀察到異常結(jié)果時，應(yīng)該由第二位科學家檢查數(shù)據(jù)，并確認錯誤，確保沒有簡單的解釋，如轉(zhuǎn)錄或計算錯誤。在開始任何調(diào)查之前，應(yīng)根據(jù)實驗室第二科學家審查程序檢查所有異常溶出數(shù)據(jù)。

5. 檢測

魚骨圖上的最后一個區(qū)域是標準溶液和樣品溶液中藥物濃度的測量。應(yīng)對方法系統(tǒng)適用性標準進行檢查和趨勢分析，以確保在預期范圍內(nèi)運行。異常的高或低標準響應(yīng)可能表明參考標準品的稱重或溶出存在問題，或燒瓶尺寸、紫外比色皿路徑長度或波長不正確。

如果使用色譜法，應(yīng)謹慎檢查流動相，以確保它們已正確制備，在保質(zhì)期內(nèi)，具有正確的pH值，并安裝在正確的流動相管線上。同樣，應(yīng)檢查色譜柱，以確保選擇了正確的相、尺寸和粒度。

如果該方法未明確說明如何進行溶出計算，或者該方法處于早期開發(fā)階段，且未充分定義和驗證，則溶出計算本身可能是問題的根源。由于不正確或不一致地使用溶出百分比值的計算，出現(xiàn)了問題。這些通常是由于取樣和針頭沖洗導致的運行過程中體積變化導致的。這可以通過使用經(jīng)驗證的工具和/或現(xiàn)成的計算工具來處理數(shù)據(jù)而容易地避免。所有溶出杯的持續(xù)低或高結(jié)果通常與計算問題或稀釋系數(shù)問題有關(guān)。

對于片劑重量、測定或沖擊轉(zhuǎn)速時間點的標準化，應(yīng)謹慎使用單獨的溶出杯校正，并應(yīng)明確標記為已校正的數(shù)據(jù)，以避免在與未校正的歷史數(shù)據(jù)進行比較時得出錯誤的結(jié)論。

最后，重要的是確保所有分析均在樣品和標準溶液的穩(wěn)定性窗口內(nèi)進行，并且所有分析樣品均正確儲存在實驗室內(nèi)（例如，如果需要，應(yīng)避光），因為未能按照驗證儲存樣品可能會使任何數(shù)據(jù)失效。

偏差調(diào)查總結(jié)

原文：Dissolution Method Troubleshooting: An Industry Perspective，James Mann等